Otra técnica propia de la Ingeniería Genética es
la determinación de la secuencia de nucleótidos de un ADN, conocida como
secuenciación de dicho ácido nucléico.
Se ha conseguido gracias a las enzimas de restricción y a la
posibilidad de obtener numerosas copias de un ácido nucléico por
clonación.
Se pueden conseguir muchos fragmentos , de diversos tamaños y lo que se trata
es de recomponer la molécula original como si se tratase de un puzzle.
Así se han secuenciado genes, desde virus hasta el genoma humano.
El método más usado para la secuenciación es el conocido como técnica de terminación de cadena de Sanger, la cual se
ha perfeccionado conociéndose actualmente como la técnica del
didesoxi.
Se denomina así por ser necesario los didesoxirribonucleótidos
(figura 1), que han perdido su grupo alcohol OH del carbono 3'. En la figura 2
vemos un nucleótido normal con el grupo alcohol en el carbono 3'.
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Abreviadamente, éste sería el método a seguir:
Como la técnica se basa en
la síntesis de ADN, para hacer la reacción de secuenciación se necesita:
Al añadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerización en el cebador, pero cesa el incorporarse un didesoxinucleótido (Figura 4).
Se produce un conjunto de cadenas dobles cuyas longitudes dependen de la situación del didesoxinucleótido incorporado. En el caso expuesto en el dibujo, esta reacción de secuenciación se hace con un didesoxi de ADENINA, lo que significa que cuando se incorpore esta Adenina no podrá continuarse la polimerización de nuevos nucleótidos, nos queda por tanto un pequeño fragmento de ADN que termina en la ADENINA, lo que nos dice que en el ADN original, en ese lugar estará el nucleótido complementario que lleva TIMINA.
En el caso expuesto deducimos tres fragmentos con 5, 10 y 14 nucleótidos (sin contar el cebador) en cuyos extremos tenemos ADENINA, nos permite interpretar que en el ADN original, en esas situtaciones tendremos TIMINA.
Deben prepararse cuatro reacciones de secuenciación, cada una con un didesoxi distinto . Los fragmentos resultantes se separan por tamaño mediante electroforesis, se autorradiografían, y la sucesión de bandas de cada una de las cuatro reacciones, comparándolas entre sí,dan la secuencia del ADN. (Figura 5)
